4月5日，Cell子刊《化學》（Chem）在線刊發了化學與化工學院鐘芳銳教授團隊和中科院生物物理所合作完成的最新研究成果“基因重構人工光敏脫鹵酶全細胞催化芳鹵氫/氘化”（Whole-cell-catalyzed hydrogenation/deuteration of aryl halides with a genetically repurposed photodehalogenase, DOI: /10.1016/j.chempr.2023.03.006）。該論文報道了首例人工光酶催化的脫鹵還原反應，將廉價易得的芳鹵類化學原料一步轉化為高附加值的氘代芳烴，并且能通過基因重組的大腸桿菌進行全細胞光生物催化，具有條件溫和、選擇性高、底物普適性廣等優點。該研究突破了天然生物酶自然進化形成的結構和功能，拓展了生物催化的反應類型和化學空間。
生物催化已經成為可持續有機合成的重要工具。然而，人類對各種非天然化學品合成的需求與自然進化形成的酶催化功能之間存在矛盾。例如，由于化學工業生產排放的一些有機鹵代物的存在，自然界逐漸進化產生了降解這些污染物的細菌，在其體內已經鑒定了某些能編碼脫鹵酶的基因。其中，以鈷胺酰胺為輔酶的還原性脫鹵酶是一類重要的家族，能將電子從犧牲還原劑（如NADPH）轉移還原芳基或烯基鹵化物底物。然而，這些天然酶通常具有明顯的底物偏好性，僅對特定底物表現出催化活性。例如，NprdhA是一種從巨大芽孢桿菌pacificus pht-3B獲得的還原性脫鹵酶，僅適用于2,6-二鹵酚類底物。從合成化學的角度來看，芳香鹵化物是合成高值精細化學品的重要原料，但目前無法通過天然進化的酶催化來實現。因此，開發底物普適性廣、能高值化轉化芳香鹵化物的人工酶，能突破以降解為綱、底物類型專一的天然脫鹵酶的功能限制，在合成生物學領域具有重要的研究意義。
鐘芳銳團隊致力于綠色仿生和人工生物催化領域的研究，基于化學原理驅動酶催化選擇性合成的理念，發展了含有非天然光敏活性基團的人工光敏金屬酶（J. Am. Chem. Soc. 2021, 143, 617）和“三重態光酶”（Nature, 2022, 611, 715），擴展了多銅氧化酶的催化雜泛性實現了非天然吲哚類底物的立體選擇性氧化交叉偶聯反應（Angew. Chem. Int. Ed., 2023, e202219034）。在上述人工生物催化研究基礎上，團隊深入開展化學和生物催化的交叉研究，利用基因密碼拓展技術重構開發了含化學光催化劑的人工光敏脫鹵酶（RPDase），通過捕獲光子能量來驅動廣譜性芳香鹵化物的脫鹵氫/氘化。與金屬輔因子依賴性的天然脫鹵酶不同，RPDase通過完全非天然的光致電子轉移催化機制進行，能利用外源性甲酸鈉為終端還原劑，從而避免了天然脫鹵酶對還原性輔酶NADPH的依賴（圖1）。
圖1.天然還原性脫鹵酶和人工光敏脫鹵酶的對比
在優化后的反應條件下，RPDase表現了較好的底物適用性（圖2）。對于吸電子基團或供電子基團取代的芳基溴化物、溴苯、4-溴苯胺、溴代吲哚、鹵代吡啶及雜環芳烴、氯代芳烴、碘代芳烴、多鹵素取代芳烴等30多個鹵代烴底物，RPDase均能將其轉化為芳烴。進一步的控制實驗發現，脫鹵還原的氫原子專一性地來源于甲酸鈉，且不受反應液介質影響。基于這一發現，團隊以氘代甲酸鈉為還原劑，發展了一種專一選擇性的生物催化脫鹵氘化反應，并成功地應用于煙酸類似物、倍他米隆甲酯、馬尿酸甲酯、沙利度胺、溴芬酸等一系列生物活性分子的氘代衍生物的制備。
圖2. RPDase催化制備生物活性分子的氘代衍生物
團隊對該人工光生物催化體系的酶催化機制進行了深入探究（圖3）。通過TEMPO自由基捕獲、瞬態吸收光譜和電子順磁共振等實驗證明了芳基自由基的生成。同位素實驗表明，甲酸鈉是非常高效的終端還原劑和氫供體，氫化效率顯著高于天然還原劑抗壞血酸鈉。此外，開關燈控制實驗發現，黑暗條件下反應會繼續進行，表明反應過程中存在一定的鏈傳遞過程?；谏鲜鰧嶒灲Y果，團隊提出了可能的光生物催化機制。在RPDase空腔微環境中，光照和甲酸鈉促使了強還原性二苯甲酮自由基陰離子和二氧化碳陰離子自由基的生成，兩者均可促進芳基鹵化物的單電子還原生成芳基自由基，并進一步捕獲甲酸鈉的氫原子或氘原子生成還原產物。
圖3 RPDase光生物催化脫鹵還原的催化機理研究
基于RPDase光催化的生物正交性和基因密碼擴展技術，團隊進一步使用表達RPDase的重組大腸桿菌細胞進行全細胞光生物催化。RPDase在活細胞條件中能同時利用內源的NADPH和外源的甲酸鈉實現芳香鹵化物的脫鹵氫化。該研究結果表明，含有非天然光催化劑的人工光生物催化有望成為廉價易得的化學原料高值化轉化的細胞工廠（圖4）。
圖4.全細胞光生物催化脫鹵還原
該工作由華中科技大學和中國科學院生物物理研究所合作完成。華中科技大學鐘芳銳教授和生物物理研究所王江云研究員為本文的共同通訊作者，華中科技大學和深圳技術大學聯合博士后付雨博士和生物物理研究所劉曉紅研究員為本文共同第一作者。華中科技大學為第一作者單位。該研究得到科技部重點研發計劃、國家自然科學基金委、中國博士后科學基金面上項目的經費支持。
文章鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2451929423001250
